所需的蛋白质纯度取决于蛋白质预期的最终用途。
对于某些应用，粗提取物就足够了。 但是，对于其他用途，例如在食品和药品中，则需要高纯度。 为了实现这一点，通常使用几种蛋白质纯化方法，在一系列纯化步骤中。
每个蛋白质纯化步骤通常导致一定程度的产物损失。 因此，理想的蛋白质纯化策略是在最少的步骤中达到最高纯化水平的策略。 选择使用哪些步骤取决于靶蛋白的大小，电荷，溶解度和其他性质。 以下技术最适合纯化单个胞质蛋白。 胞质蛋白复合物的纯化更复杂，通常需要应用不同的方法。
蛋白质纯化的第一步
纯化细胞内 （细胞内）蛋白质的第一步是制备粗提取物 。
提取物将含有来自细胞质的所有蛋白质的复杂混合物，以及一些额外的大分子，辅因子和营养素。 粗提取物可用于生物技术的一些应用，然而，如果纯度是个问题，则必须遵循随后的纯化步骤。
通过去除细胞裂解产生的细胞碎片来制备粗蛋白质提取物，细胞裂解使用化学品和酶 ，超声处理或French Press实现。 通过离心去除碎片，并回收上清液。 细胞外蛋白质的粗制品可以通过简单地通过离心除去细胞来获得。
对于某些生物技术应用，需要热稳定酶 ：可以耐受高温而不变性，同时保持高比活性的酶。 生产它们的有机体有时被称为极端微生物。 纯化耐热蛋白质的一种简单方法是通过加热使混合物中的其他蛋白质变性，然后冷却溶液（如果需要，使热稳定酶重新形成或重新溶解）。然后可以通过离心除去变性的蛋白质。
中间纯化步骤
过去，从粗提物中纯化蛋白质的常见第二步是通过在具有高渗透强度的溶液（即盐溶液）中沉淀 。 粗提取物中的核酸可以通过沉淀由硫酸链霉素或硫酸鱼精蛋白形成的聚集物来除去。
蛋白质沉淀通常使用硫酸铵作为盐来完成。
不同的蛋白质会在不同浓度的硫酸铵中沉淀 。 通常，较高分子量的蛋白质在较低浓度的硫酸铵中沉淀。 盐沉淀通常不会导致高度纯化的蛋白质，但可以帮助消除混合物中的一些不需要的蛋白质并浓缩样品。 然后通过多孔纤维素管透析，过滤或凝胶排阻色谱法除去溶液中的盐。
现代生物技术协议通常利用许多商用套件，为标准程序提供现成的解决方案。 通常使用过滤器和制备的凝胶过滤柱进行蛋白质纯化。 您只需按照说明进行操作，并添加适量的正确溶液，并在收集新鲜试管中的洗脱液（柱的另一端）时等待指定的时间。
- 色谱方法可以使用台式色谱柱或自动HPLC设备进行应用。 通过HPLC分离可以通过反相，离子交换或尺寸排阻方法进行分离，并通过二极管阵列或激光技术检测样品。
蛋白质可视化和纯化评估
- 反相色谱 （RPC）根据其相对疏水性分离蛋白质。 该技术具有很高的选择性，但需要使用有机溶剂。 一些蛋白质被溶剂永久变性，在RPC期间会失去功能。 因此不建议将这种方法用于所有应用，特别是如果目标蛋白质有必要保持活性。
- 离子交换色谱是指基于电荷的蛋白质分离。 色谱柱可以用于阴离子交换或阳离子交换。 阴离子交换柱包含带正电荷的固定相，吸引带负电荷的蛋白质。 阳离子交换柱是反向的带负电荷的珠子，它吸引带正电荷的蛋白质。 通过改变柱中的pH来完成靶蛋白的洗脱，这导致每种蛋白质的带电官能团的改变或中和。
- 尺寸排阻色谱（ 凝胶过滤 ）将较大的蛋白与小的蛋白分离，因为较大的分子通过色谱柱中的交联聚合物更快地移动。 大蛋白质不适合聚合物的孔隙，而较小的蛋白质则适用，并且需要更长的时间才能穿过色谱柱，通过它们较不直接的路线。 根据洗脱时间将洗脱物收集在一系列分离蛋白质的管中。 凝胶过滤是浓缩蛋白质样品的有用工具，因为目标蛋白质的收集量要比最初加入色谱柱的洗脱体积小。 由于其成本效益，在大规模蛋白质生产过程中可能会使用类似的过滤技术。
- 亲和色谱法是“抛光”或完成蛋白质纯化过程的非常有用的技术。 色谱柱中的珠子与特异性结合靶蛋白的配体交联。 然后通过用含有游离配体的溶液漂洗将蛋白质从柱中除去。 与其他技术相比，此方法提供最纯粹的结果和最高的比活性。
- SDS-PAGE是聚丙烯酰胺凝胶电泳，在SDS（十二烷基硫酸钠）存在下进行，所述SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，给它们带来大的净负电荷。 由于所有蛋白质的电荷都相当相等，这种方法几乎完全基于大小将它们分开。 在一系列的每一步后，SDS-PAGE通常用于检测蛋白质的纯度。 随着不需要的蛋白质逐渐从混合物中除去，SDS-PAGE凝胶上可见的条带数量减少，直到仅有一条代表所需蛋白质的条带。
- 免疫印迹是与亲和层析结合使用的蛋白质可视化技术。 用于特定蛋白质的抗体在亲和层析柱上用作配体。 目标蛋白质保留在柱上，然后通过用盐溶液或其他试剂冲洗柱来除去。 与放射性标记或染料标记相连的抗体一旦从混合物的其余部分分离就有助于检测靶蛋白。
资料来源：
Zubay G.1988.Biochemistry，2nd Edition。 Macmillan Publishing Co.，New York，NY，USA。
Amersham Pharmacia Biotech。 蛋白质纯化手册，版本AB。 Amersham Pharmacia Biotech Inc.美国新泽西州。 http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf。