对聚合酶链式反应（PCR）反应中任何组分的调整可以改变结果的质量，或者通过改进或者减少产物产量和质量，或者通过改进反应特异性和灵敏度来改变。 影响最终结果的参数可以是物理的（即温度，循环时间）或化学的（即模板浓度，使用的酶的类型）。 以下是影响PCR成功的几个关键因素。
01清洁实验室条件
由于PCR能够检测到单个DNA分子，因此在实验室保持原始状态很重要。 始终佩戴新鲜手套，使用无菌玻璃器皿，管子和移液器吸头以及无菌溶液，并在开始工作前清洁工作区域。
始终包括没有模板DNA和无酶的对照反应，以确保结果真正归因于正确样品的扩增。
大多数人确保有自己的解决方案，不共享，使故障排除更容易，指定的移液器通常仅用于PCR。 脱氧核糖核酸酶和无RNA酶的PCR管，防气溶胶吸头和在带紫外灯的通风橱中工作也是最大限度减少问题的方法。
02化学成分
- 有18至24个基地
- 没有二级结构（即发夹环）
- G / C和A / T对均衡分配
- 在3英尺的两端不能互补
- 熔化温度（Tm）在退火温度以下约5-10摄氏度，通常在55和65摄氏度之间
两种引物的Tm也应该相似以获得最佳结果。
03反应混合物：模板和引物
最佳引物浓度在0.1和0.6微摩尔/ L之间。 模板量取决于DNA的类型（人类，细菌，质粒）。
由于模板数量非常少，因此还有其他策略可以改善结果，如增加周期数或使用“热启动”。 总是用阳性对照反应测试新引物，确保它们在特定的实验条件下工作。
04反应混合物：酶活性
反应混合物中MgCl 2的浓度可影响PCR结果，并可在更苛刻的反应中起重要作用。 镁阳离子与dNTP形成可溶性复合物以产生聚合酶识别的实际底物。
等量的全部四种dNTP也有助于降低聚合酶错误率。 某些添加剂如甜菜碱，BSA，去垢剂，DMSO，甘油和焦磷酸酶也会影响酶的特异性或反应效率。
05型热循环仪
购买实验室设备时，请记住，某些热循环仪在维持精确的所需温度时比其他热循环仪精确度低。
当您面临挑剔的反应或使用需要窄范围退火温度的引物时，从长远来看，这是一个便宜的产品。
设计用于符合您使用的热循环仪的精确品牌的薄壁反应管，也有助于优化反应温度。
06周期设置
通过增加大约每20个循环的延伸时间可以获得增加的产量，以补偿较少的酶以扩增更多的模板。 通常，少于40个循环就足以将少于10个模板分子放大到足以在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上观察的浓度。